FC-121-4003 TruSeq Nano DNA HT Library Preparation Kit 用戶(hù)指南

——高效、低樣本量DNA文庫(kù)構(gòu)建解決方案

一、產(chǎn)品概述

FC-121-4003 TruSeq Nano DNA HT Library Preparation Kit（貨號(hào)：FC-121-4003）是一款專(zhuān)為Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)設(shè)計(jì)的DNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，適用于低起始量DNA樣本（100 ng）的高效建庫(kù)。該試劑盒基于磁珠純化技術(shù)，通過(guò)優(yōu)化PCR擴(kuò)增和片段選擇流程，顯著降低文庫(kù)偏差（bias）和覆蓋度缺口（coverage gaps），為全基因組重測(cè)序、靶向測(cè)序及表觀遺傳學(xué)研究提供高質(zhì)量數(shù)據(jù)支持。

核心參數(shù)：

• 規(guī)格：96樣本/板（96 indexes in plate format）

• 適用樣本類(lèi)型：基因組DNA（gDNA）

• 起始量：100 ng（350 bp插入片段）或200 ng（550 bp插入片段）

• 文庫(kù)構(gòu)建時(shí)間：<1天（手動(dòng)操作）

• 兼容讀長(zhǎng)：2×101 bp至2×151 bp

• 儲(chǔ)存條件：-15℃至-25℃避光保存

二、技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1. 低樣本量兼容性

• 微量DNA輸入：僅需100 ng起始量，適用于腫瘤組織、FFPE樣本等珍貴樣本的建庫(kù)。

• 樣本保護(hù)：減少DNA消耗，保留樣本用于后續(xù)分析。

2. 高覆蓋度與低偏差

• 磁珠純化替代凝膠回收：避免傳統(tǒng)凝膠電泳導(dǎo)致的樣本損失，提升回收率。

• 優(yōu)化PCR擴(kuò)增：減少PCR誘導(dǎo)的覆蓋度缺口，GC富集區(qū)、啟動(dòng)子及重復(fù)序列的覆蓋度顯著提升。

3. 高通量支持

• 96樣本并行處理：96孔板格式設(shè)計(jì)，適配自動(dòng)化平臺(tái)（如Biomek i7），單次運(yùn)行可處理96個(gè)樣本。

• 靈活索引配置：提供96種索引，避免樣本混淆。

4. 快速工作流程

• 簡(jiǎn)化操作：預(yù)混試劑減少移液步驟，降低操作誤差。

• 單日建庫(kù)：從DNA片段化到文庫(kù)富集，全流程可在1天內(nèi)完成。

三、操作指南

（一）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1. 試劑與耗材

• FC-121-4003 TruSeq Nano DNA HT Library Preparation Kit

• 96孔PCR板、磁力架、移液器（10-1000 μL）、Qubit熒光定量?jī)x

• 超聲波打斷儀（如Covaris）、AMPure XP磁珠

2. 樣本準(zhǔn)備

• DNA質(zhì)量評(píng)估：使用Qubit或PicoGreen定量，A260/A280比值≥1.8。

• 片段化：將DNA片段化至350 bp或550 bp（推薦Covaris超聲波打斷）。

（二）實(shí)驗(yàn)操作

1. 末端修復(fù)與加A尾

• 將片段化DNA與末端修復(fù)酶混合，37℃孵育30分鐘，72℃孵育30分鐘。

• 加入dATP和Taq酶，72℃孵育30分鐘，完成加A尾。

2. 接頭連接

• 添加預(yù)混的接頭（Adapters）和連接酶，20℃孵育15分鐘。

3. 磁珠純化

• 使用AMPure XP磁珠回收連接產(chǎn)物，去除未結(jié)合的接頭。

4. PCR擴(kuò)增

• 98℃ 30秒

• 98℃ 10秒 → 60℃ 30秒 → 72℃ 30秒（循環(huán)數(shù)：8-12）

• 72℃ 5分鐘

• 配置PCR反應(yīng)體系（含Index Primer），按以下程序擴(kuò)增：

5. 文庫(kù)富集與質(zhì)量控制

• 再次使用磁珠純化PCR產(chǎn)物，Qubit定量并使用Agilent Bioanalyzer或TapeStation檢測(cè)片段分布。

（三）實(shí)驗(yàn)后處理

• 文庫(kù)混合：將等量文庫(kù)混合后，使用KAPA Library Quantification Kit定量。

• 上機(jī)測(cè)序：稀釋至4 nM，與PhiX質(zhì)控DNA混合后上機(jī)（建議比例：5% PhiX）。

四、使用技巧與高效操作

1. 優(yōu)化DNA片段化

• 片段大小：350 bp（Duty Factor 10%，Peak Incident Power 175，Cycles/Burst 200，Time 60秒）

• 片段大小：550 bp（Duty Factor 10%，Peak Incident Power 175，Cycles/Burst 200，Time 120秒）

• 使用Covaris ME220超聲波打斷儀，參數(shù)建議：

2. 提高文庫(kù)質(zhì)量

• 磁珠純化時(shí)，確保DNA與磁珠比例（推薦1:0.8），避免過(guò)度清洗導(dǎo)致DNA損失。

• PCR循環(huán)數(shù)根據(jù)起始量調(diào)整（100 ng DNA建議10-12個(gè)循環(huán)）。

3. 質(zhì)量控制要點(diǎn)

• Qubit定量：確保文庫(kù)濃度≥2 nM。

• Bioanalyzer分析：主峰應(yīng)在目標(biāo)片段大小±20 bp范圍內(nèi)，無(wú)接頭二聚體峰。

五、注意事項(xiàng)

1. 安全規(guī)范

• 操作時(shí)佩戴手套與護(hù)目鏡，避免試劑接觸皮膚或吸入。

• 廢棄物需按化學(xué)危險(xiǎn)品處理。

2. 操作細(xì)節(jié)

• 移液精度：使用校準(zhǔn)后的移液器，誤差<±1%。

• 溫度控制：確保試劑和文庫(kù)在規(guī)定溫度下儲(chǔ)存和處理。

3. 故障排除

• 文庫(kù)濃度低：檢查PCR循環(huán)數(shù)是否過(guò)低或磁珠純化效率。

• 片段分布異常：調(diào)整片段化參數(shù)或延長(zhǎng)磁珠純化時(shí)間。

六、用戶(hù)評(píng)價(jià)與支持

• 用戶(hù)反饋：

• “FC-121-4003試劑盒顯著降低了FFPE樣本的建庫(kù)失敗率，數(shù)據(jù)質(zhì)量穩(wěn)定。"

• “磁珠純化流程簡(jiǎn)單高效，適合高通量樣本處理。"